摘要：

本研究采用豬尾小組織塊貼壁培養(yǎng)法成功分離培養(yǎng)出原代豬成纖維細胞，并進行了不同時期的綠色熒光蛋白(GFP)陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的研究。實驗結(jié)果顯示，原代細胞具有較高的轉(zhuǎn)染效率，且傳代和復(fù)蘇細胞亦能成功轉(zhuǎn)染。該研究為豬成纖維細胞的基因編輯和體細胞克隆提供了有價值的參考。

引言：

成纖維細胞作為重要的供體細胞之一，在醫(yī)學(xué)、動物科學(xué)及基礎(chǔ)研究中具有廣泛的應(yīng)用價值。在醫(yī)學(xué)上，成纖維細胞可用于疾病診斷、人工皮膚制備、組織創(chuàng)傷修復(fù)及組織器官培養(yǎng)等方面。在動物科學(xué)領(lǐng)域，成纖維細胞則可用于體細胞克隆及轉(zhuǎn)基因研究，以實現(xiàn)瀕危畜禽的保種及擴繁、優(yōu)良品種的快速繁育及轉(zhuǎn)基因新品種的培育。此外，在基礎(chǔ)研究中，成纖維細胞為遺傳學(xué)、細胞學(xué)、胚胎學(xué)、組織學(xué)及免疫學(xué)等提供了基礎(chǔ)材料和分離培養(yǎng)模式。

鑒于成纖維細胞的重要性，建立一種快速、實用、簡便的豬成纖維細胞分離培養(yǎng)方法顯得尤為重要。豬尾小組織塊貼壁培養(yǎng)法作為一種有效的分離培養(yǎng)方法，具有操作簡便、細胞分裂增殖能力強、適應(yīng)性好及性狀穩(wěn)定等優(yōu)點。然而，關(guān)于該方法分離出的成纖維細胞的轉(zhuǎn)染效率研究尚不充分。因此，本研究旨在通過豬尾小組織塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)出原代豬成纖維細胞，并探究其不同時期的GFP陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，為豬成纖維細胞的基因編輯和體細胞克隆提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

材料與方法：

1. 材料

實驗動物選用新生小豬，超凈工作臺、威尼德電穿孔儀、超低溫冰箱、CO2培養(yǎng)箱、眼科剪、培養(yǎng)瓶、離心管、血球計數(shù)板等儀器，以及乙醇、PBS溶液、某品牌DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、中性蛋白酶、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、臺盼藍、EDTA、DMSO等試劑。

2. 方法

2.1 豬尾小組織塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)成纖維細胞

新生小豬出生后立即取其尾尖組織，以75%酒精擦拭消毒后，用手術(shù)剪刀剪下約2cm長的豬尾組織，投入75%酒精中浸泡60秒后，以無菌PBS沖洗3次，轉(zhuǎn)移至含有15%FBS的某品牌DMEM細胞培養(yǎng)基中，置于冰盒后帶回實驗室。在安全柜內(nèi)，用PBS（含雙抗）洗滌豬尾組織數(shù)次后，剪下長約1.5cm的組織塊，轉(zhuǎn)移至另一無菌直徑為10cm的玻璃培養(yǎng)皿中，加入幾滴血清后以彎頭手術(shù)剪刀剪碎至1mm3小塊。加入20mL消化緩沖液，放入39℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中進行消化。消化后的組織塊貼壁培養(yǎng)于含有10%FBS的某品牌DMEM培養(yǎng)基中，定期觀察并更換培養(yǎng)基。待細胞生長至80%-90%匯合時，進行傳代培養(yǎng)。

2.2 細胞凍存與復(fù)蘇

選擇生長狀態(tài)良好的細胞進行凍存。將細胞用胰蛋白酶消化后，離心收集細胞沉淀，加入含有10%DMSO和90%FBS的凍存液，混勻后分裝至凍存管中，置于-80℃冰箱過夜后，轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期保存。復(fù)蘇時，將凍存管從液氮罐中取出，迅速置于37℃水浴中解凍，將細胞懸液轉(zhuǎn)入含有10%FBS的某品牌DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至細胞貼壁后更換新鮮培養(yǎng)基。

2.3 GFP陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

采用威尼德電穿孔儀進行細胞轉(zhuǎn)染。將細胞消化后計數(shù)，調(diào)整細胞密度至1×10^6個/mL。取100μL細胞懸液與適量GFP陽性質(zhì)?；靹蚝?，加入電穿孔杯中。設(shè)置電穿孔參數(shù)為電壓1200V/cm，脈沖時間3ms。電轉(zhuǎn)染后，將細胞轉(zhuǎn)入含有10%FBS的某品牌DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。分別在轉(zhuǎn)染后24小時和48小時，采用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測細胞的GFP質(zhì)粒陽性表達率。

結(jié)果：

1. 豬尾小組織塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)成纖維細胞

采用豬尾小組織塊貼壁培養(yǎng)法成功分離培養(yǎng)出原代豬成纖維細胞。細胞形態(tài)呈多邊形，生長均勻，貼壁良好。原代細胞活力很高，細胞存活率達到97.670%。經(jīng)過傳代培養(yǎng)后，細胞存活率仍為95.670%。復(fù)蘇后的細胞存活率亦在90%以上，且能保持原代細胞的生物學(xué)特性。原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)和復(fù)蘇培養(yǎng)細胞的生長曲線均呈“S"型，但復(fù)蘇細胞的生長速度略微緩慢。

2. GFP陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率

原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)和復(fù)蘇培養(yǎng)細胞在電轉(zhuǎn)染后均能成功表達GFP質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后24小時，熒光顯微鏡即可檢測到GFP質(zhì)粒陽性表達的成纖維細胞。轉(zhuǎn)染后48小時，流式細胞儀檢測顯示原代細胞陽性率為8.01%，稍高于傳代細胞的7.91%和復(fù)蘇細胞的7.86%。復(fù)蘇細胞存活率有所下降，轉(zhuǎn)染后細胞活力亦有所降低，但轉(zhuǎn)染后仍可得到7.86%的GFP質(zhì)粒陽性表達率。

討論：

1. 豬尾小組織塊貼壁培養(yǎng)法的優(yōu)勢

本研究采用豬尾小組織塊貼壁培養(yǎng)法成功分離培養(yǎng)出原代豬成纖維細胞。該方法操作簡便，對細胞損傷小，且細胞分裂增殖能力強，適應(yīng)性好，性狀穩(wěn)定。此外，該方法還能模擬體內(nèi)生長狀況，簡化生長環(huán)境，明確生長條件，便于施加實驗因素及獲得直接活體觀察結(jié)果。因此，豬尾小組織塊貼壁培養(yǎng)法在豬成纖維細胞的分離培養(yǎng)中具有廣泛應(yīng)用前景。

2. 轉(zhuǎn)染效率的影響因素

原代細胞為混雜細胞，且比較脆弱、不穩(wěn)定，因此其轉(zhuǎn)染條件無法沿用純化建系的細胞。本研究在電轉(zhuǎn)染過程中，對電壓和脈沖時間進行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，在電壓1200V/cm、脈沖時間3ms的條件下，細胞轉(zhuǎn)染效率高。此外，GFP陽性質(zhì)粒的濃度對原代細胞的電轉(zhuǎn)染率影響較小，當其濃度達到一定值后，轉(zhuǎn)染率間無顯著差異。這一結(jié)果與傳代細胞系相似。

3. 研究的創(chuàng)新與應(yīng)用前景

本研究的創(chuàng)新之處在于采用豬尾小組織塊貼壁培養(yǎng)法成功分離培養(yǎng)出原代豬成纖維細胞，并探究了其不同時期的GFP陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。研究結(jié)果為豬成纖維細胞的基因編輯和體細胞克隆提供了有價值的參考。在應(yīng)用前景方面，該方法可用于轉(zhuǎn)基因豬的制備、疾病模型的建立以及瀕危畜禽的保種及擴繁等領(lǐng)域。此外，該方法還可為其他物種成纖維細胞的分離培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染效率研究提供借鑒和參考。