摘要

本文研究了基于定向改造的釀酒酵母丙酮酸積累，通過(guò)基因敲除和發(fā)酵條件優(yōu)化，顯著提高了釀酒酵母中丙酮酸的積累量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，優(yōu)化后的釀酒酵母菌株丙酮酸積累量提高了168%，為丙酮酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的策略。

引言

丙酮酸是生物細(xì)胞內(nèi)糖酵解途徑（EMP）中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，不僅在生物能量代謝中具有重要作用，而且是多種有用物質(zhì)的前體，廣泛應(yīng)用于化工、農(nóng)藥、農(nóng)用化學(xué)品及生物制藥等領(lǐng)域。目前，丙酮酸的生產(chǎn)主要依賴于微生物發(fā)酵，其中光滑球擬酵母（Torulopsis glabrata）是常用的生產(chǎn)菌株。然而，光滑球擬酵母是一種條件致病菌，存在潛在的安全威脅。相比之下，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為一種的安全菌，在食品工業(yè)和酒精生產(chǎn)中有著廣泛應(yīng)用，因此更適合作為丙酮酸的生產(chǎn)菌株。

釀酒酵母中的丙酮酸主要通過(guò)糖酵解途徑生成，并隨后進(jìn)入乙醇發(fā)酵途徑被轉(zhuǎn)化為乙醇和二氧化碳。為了提高釀酒酵母中丙酮酸的積累量，需要阻斷乙醇生成途徑，使代謝流更多地流向丙酮酸。丙酮酸脫羧酶（PDC）是催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛的關(guān)鍵酶，通過(guò)敲除PDC基因，可以阻斷乙醇生成途徑，從而提高丙酮酸的積累量。

本研究旨在通過(guò)定向改造釀酒酵母，敲除PDC基因，并通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化，提高丙酮酸的積累量。這不僅有助于解決光滑球擬酵母的安全性問(wèn)題，還能為丙酮酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供新的策略。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)材料

• 菌株：釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y2

• 試劑：某試劑G418、某試劑醋酸鋰、某試劑PCR試劑、某試劑Southern blot試劑、某試劑葡萄糖、某試劑蛋白胨、某試劑酵母粉、某試劑KH2PO4、某試劑MgSO4·7H2O、某試劑醋酸鈉、某試劑玉米漿

• 儀器：威尼德電穿孔轉(zhuǎn)化儀、某品牌PCR儀、某品牌凝膠成像系統(tǒng)、某品牌搖床、某品牌發(fā)酵罐

2. 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 基因敲除

1. pdcl基因敲除：設(shè)計(jì)pdcl基因的敲除片段（P1K），通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化法將敲除片段轉(zhuǎn)化到釀酒酵母S. cerevisiae Y2中，在含G418抗性的YEPD平板上篩選轉(zhuǎn)化子。通過(guò)PCR和Southern blot驗(yàn)證得到pdcl基因的敲除菌株S. cerevisiae Y2-1。

2. pdc5基因敲除：設(shè)計(jì)pdc5基因的敲除片段（P5H），通過(guò)醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將敲除片段轉(zhuǎn)化到S. cerevisiae Y2-1中，在YNBG平板上篩選轉(zhuǎn)化子。通過(guò)PCR和Southern blot驗(yàn)證得到pdcl和pdc5基因都缺失的菌株S. cerevisiae Y2-15。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

1. 種子培養(yǎng)基：葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，醋酸鈉2g/L，玉米漿0.5%，pH 5.6。

2. 發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，醋酸鈉2.5g/L，玉米漿1%，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，金屬離子母液5mL，pH 5.6。

3. 發(fā)酵條件：種齡26h，接種量12%，裝液量70mL/250mL三角瓶。

2.3 丙酮酸測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵液中丙酮酸的濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 基因敲除結(jié)果

通過(guò)PCR和Southern blot驗(yàn)證，成功得到了pdcl基因敲除菌株S. cerevisiae Y2-1和pdcl、pdc5基因都缺失的菌株S. cerevisiae Y2-15。

2. 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

優(yōu)化后的發(fā)酵條件下，S. cerevisiae Y2-15的丙酮酸積累量顯著提高。與優(yōu)化前相比，丙酮酸的積累量從9.25g/L提高到24.85g/L，提高了168%。

討論

1. 基因敲除對(duì)丙酮酸積累的影響

PDC基因是釀酒酵母中催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛的關(guān)鍵酶基因。通過(guò)敲除PDC基因，阻斷了乙醇生成途徑，使代謝流更多地流向丙酮酸。本研究中，首先敲除了pdcl基因，得到S. cerevisiae Y2-1菌株，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步敲除了pdc5基因，得到S. cerevisiae Y2-15菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲除兩個(gè)PDC基因后，丙酮酸的積累量顯著提高，說(shuō)明基因敲除策略是有效的。

2. 發(fā)酵條件優(yōu)化對(duì)丙酮酸積累的影響

發(fā)酵條件對(duì)微生物代謝產(chǎn)物的積累具有重要影響。本研究通過(guò)優(yōu)化種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，顯著提高了S. cerevisiae Y2-15菌株的丙酮酸積累量。優(yōu)化后的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基提供了適宜的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比例和濃度，有利于菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的積累。優(yōu)化后的發(fā)酵條件，如種齡、接種量和裝液量，有利于氧氣的傳遞和菌體的代謝活動(dòng)，從而提高了丙酮酸的積累量。

3. 研究的創(chuàng)新與應(yīng)用前景

本研究通過(guò)定向改造釀酒酵母，敲除PDC基因，并通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化，顯著提高了丙酮酸的積累量。這種策略不僅解決了光滑球擬酵母的安全性問(wèn)題，還為丙酮酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的思路。釀酒酵母作為一種的安全菌，在食品工業(yè)和酒精生產(chǎn)中有著廣泛應(yīng)用，因此，改造后的釀酒酵母菌株具有廣闊的應(yīng)用前景。此外，本研究中的基因敲除和發(fā)酵條件優(yōu)化策略也可以為其他微生物代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)提供借鑒。

丙酮酸作為一種重要的有機(jī)酸，在化工、農(nóng)藥、農(nóng)用化學(xué)品及生物制藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸將成為未來(lái)的主要趨勢(shì)。本研究通過(guò)定向改造釀酒酵母，提高了丙酮酸的積累量，為丙酮酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的策略，具有重要的理論和實(shí)踐意義。

結(jié)論

本研究通過(guò)定向改造釀酒酵母，敲除PDC基因，并通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化，顯著提高了丙酮酸的積累量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，優(yōu)化后的釀酒酵母菌株丙酮酸積累量提高了168%。這種策略不僅解決了光滑球擬酵母的安全性問(wèn)題，還為丙酮酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的思路。改造后的釀酒酵母菌株具有廣闊的應(yīng)用前景，為丙酮酸的生產(chǎn)和應(yīng)用提供了新的策略。本研究為其他微生物代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)提供了借鑒，具有重要的理論和實(shí)踐意義。

通過(guò)上述研究，我們不僅提高了釀酒酵母中丙酮酸的積累量，還為丙酮酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的策略。未來(lái)，我們將繼續(xù)深入研究釀酒酵母的代謝調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件，提高丙酮酸的產(chǎn)量和質(zhì)量，為丙酮酸的應(yīng)用提供更廣闊的空間。